Влияние Тимодепрессина на пролиферацию кроветворных клеток-предшественников человека.

Е.Б.Владимирская1, Е.Ю.Осипова1, А.А.Иванова1, В.И.Дейгин2.

1 НИИ детской гематологии МЗ РФ,  2 фирма «Пептос»

 

Изучение общей фармакологической и специфической активности синтетического пептидного препарата Тимодепрессина (фирма “Пептос”) показало, что наряду с выраженным иммуносупрессивным действием, аналогичным Циклоспорину А, препарат оказывает существенное воздействие на кроветворную систему. Данные, полученные на экспериментальных животных  ex vivo и in vivo, указывают на следующие эффекты: подавление пролиферации ранних кроветворных предшественников (КОЕс 12 дня) при стимуляции колониеобразования коммитированных предшественников (КОЕс 8 дня), более быстрое восстановление предшественников обоих типов при использовании препарата в условиях подавлении гемопоэза облучением и химиотерапией у лабораторных животных [4]. Это явилось основанием для изучения влияния Тимодепрессина на кроветворные предшественники человека.

Материал и методы исследования.

Материалом исследования служили кроветворные предшественники, выделенные из донорского костного мозга и пуповинной крови недоношенных новорожденных 35-36 недель гестации. Влияние Тимодепрессина на пролиферативный потенциал предшественников изучали в 2-х культуральных системах; метилцеллюлезе и мягком агаре.

При исследовании в системе «агаровая капля - жидкая среда» мононуклеарные клетки культивировали в агаре (0,5 мл. 0,3 % агара) в концентрации 2 х 105 клеток в мл. Смесь лейкоцитов двух здоровых доноров в концентрации 1 х 106 /мл. добавлялась в качестве источника ростовых факторов  в 2,5 мл.  полной средеы Mc’Coy (Gibco Laboratories, USA)

Клетки культивировали в 40 мл. пластиковых чашках при 370С в условиях абсолютной влажности и 7% СО2 в течение 7 дней.  Культивирование каждой пробы проводили параллельно с фидерными клетками (стандартные условия) и в среде, не содержащей фидера (нулевые культуры). Каждую пробу проводили в 2-3 повторах.

Колониеобразующую способность (КОС) и кластерообразующую способность (КлОС) оценивали по числу колоний (более 20  клеток в агрегатах) и кластеров (от 5 до 19 клеток). Эффективность клонирования (ЭК) определяли по сумме числа колоний и кластеров в расчете на 1 х 105 эксплантированных клеток. Пролиферативный потенциал предшественников оценивали по соотношению числа колоний и кластеров  в культурах.

Пи культивировании в метилцеллюлозе 3 х 104 мононуклеарных клеток суспензировали в 1 мл. среды «Complete Methylcellulose Mtdium” (фирма Terry Fox Laboratories, Canada), содержащей 1,2 мл. 2,3 % метилцеллюлозы, 300 мкл. Эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 мкл.бычьего сывороточного альбумина ( ВСА ), 10 мкл. 10 мМ 2 меркаптоэтанола, 10 мкл. 2мМ L-глютамина,  2,5 U эритропоэтина, 1000 U GM-CSF, 50 U 11-3, 10 мкл. раствора антибиотиков.

Клетки культивировались в 40 мм. пластиковых чашках при 370С в условиях абсолютной влажности и 7 % СО2 в течение 14 дней (в 2-3 повторах). Оценка результатов клоногенного культивирования в метилцеллюлозе проводилась с подсчетом числа колониеобразующих предшественников каждого вида на 105 эксплантированных клеток. Были проанализированы следующие показатели: КОЕмикс - смешанные колонии (ранние предшественники); БОЕ – бурстобразующие клетки (ранние, неэритропоэтинчувствительные эритроидные предшественники); КОЕэр – эритропоэтинчувствительные эритроидные предшественники; КОЕгм – гранулоцитарно/макрофагальные предшественники; КОЕг – гранулоцитарные предшественники; КОЕм –макрофагальные предшественники.

Для культивирования клетки-предшественники выделяли из пуповинной крови и костного мозга в составе мононуклеарной фракции по обычной методике в градиенте плотности 1077 фиколла.

Тимодепрессин (фирма «Пептос») использовали в 4-х конечных концентрациях: 0,005 мкг/мл; 0,05 мкг/мл; 1,0 мкг/мл; 10 мкг/мл.

Действие Тимодепрессина изучали при постоянном контакте его с клетками- предшественниками (введение в клеточную суспензию при постановке культуры) и при 1-часовой инкубации с мононуклеарными клетками перед эксплантацией. 1-часовую инкубацию проводили, добавляя Тимодепрессин к мононуклеарным клеткам, содержащимся в полной питательной среде в концентрации 1х106 / мл, в СО2-инкубаторе при 370 С, с последующим отмыванием. Контролем служили те же клетки, преинкубированные  в идентичных условиях без тимодепрессина .

 

Результаты.

Для изучения влияния Тимодепрессина на результаты культивирования кроветворных предшественников было использовано 4 конечные концентрации Тимодепрессина: 0,005 мкг/мл; 0,05 мкг/мл; 1,0 мкг/мл и 10,0 мкг/мл. В качестве контроля при каждом исследовании проводилось параллельно культивирование без добавления Тимодепрессина.

Для удобства анализа результатов культивирования в метилцеллюлезе предшественники были объединены в следующие группы: ранние – КОЕмикс; эритроидные – БОЕ + КОЕэр; гранулоцитарно/макрофагальные – КОЕгм + КОЕм + КОЕг.

Результаты культивирования предшественников, полученных из разных источников (костного мозга, пуповинной крови 38 и 39 недель гестации) представлены в табл.1

Таблица 1

Влияние Тимодепрессина на эффективность клонирования кроветворных предшественников в мелилцеллюлозе (M + m)

 

ЭК х 105 эксплантируемых клеток

 

КОЕ микс

КОЕ эр

БОЕ

КОЕ г/м

Контроль

1,75 + 0,54

18,1 + 4,6

8,8 + 2,5

46,5 + 7,7

Тд 10 мкг/мл

0,2+0,1*****

1,8 + 0,7**

1,5 + 0,9****

11 , + 3,6***

Тд 1 мкг/мл

0,3 + 0,1

5,6 + 3,0

3,3 + 1,3

30,6 + 6,1

Тд 0,05мкг/мл

2,3 + 1,4

7,8 + 3,3

6,5 + 2,0

46,1 + 13,4

Тд 0,005мкг/мл

8,2 + 3,9

7,5 + 1,0*****

7,8 + 3,9

59,7 + 8,5

 

*       - p  < 0,0001                                                           ***     - p < 0,01

**     - p < 0,001                                                              ****   - p < 0,02

***** - p < 0,05

     Для удобства сравнения полученных результатов использовали показатель  КР – кратность изменения эффективности клонирования (ЭК) под действием исследуемых доз Тимодепрессина по отношению к контролю (К). Очевидно, что значение данной величины больше 1 (>1) свидетельствует о стимулирующем действии добавленного препарата, а менее 1 – о его ингибирующем влиянии.

 

 

 

 

 

Таблица 2

Значение КР при культивировании в метилцеллюлозе различных типов кроветворных предшественников под влиянием Тимодепрессина (M + m)

Показа-тель

                             Дозы Тимодепрессина

 

 

10 мкг/мл

1 мкг/мл

0,05 мкг/мл

0,005 мкг/мл

1

КР микс

0,07 + 0,05

0,12 + 0,1

0,61 + 0,16

4,5 + 2,7

2

КР эр

0,194 + 0,07

0,48 + 0,21

0,98 + 0,18

2,1 + 0,8

3

КР г/м

0,36 + 0,13

0,69 + 0,06

1,11 + 0,12

1,3 + 0,07

 

    Полученные результаты свидетельствуют о том, что высокие дозы подавляют эффективность клонирования всех типов предшественников, в особенности КОЕ микс, в меньшей степени – КОЕ эр и еще в меньшей – КОЕ г/м. С уменьшением дозы ингибирующее действие препарата снижается. Доза 1 мкг/мл вызывает меньшую степень подавляющего эффекта на предшественники всех уровней, однако, достоверность различия сохраняется. Дальнейшее снижение дозы (0,05 мкг/мл) вызывает дискордантный эффект: некоторая степень ингибиции сохраняется только на самых ранних (КОЕ микс) предшественниках, а на КОЕ эр и КОЕ г/м препарат практически не оказывает действия. При использовании малых доз Тимодепрессина (0,005 мкг/мл) происходит инверсия - стимуляция всех видов предшественников: в большей степени КОЕ микс (в 4,5 раза),  КОЕ эр в 2 раза и отмечена некоторая стимуляция  КОЕ г/м.   

    Представляло также интерес выяснить, существует ли различие в воздействии Тимодепрессина на предшественники в зависимости от времени контакта с ними: постоянное введение и одночасовая инкубация. Для исследований культуры при кратковременной инкубации использовались две крайние концентрации препарата (10 мкг/мл и 0,005 мкг/мл), обладающие, как было установлено ранее, полярным действием. Полученные результаты представлены в таблице № 3.

 

 

Таблица 3

Значения КР при культивировании в метилцеллюлозе различных типов предшественников при постоянном введении и кратковременной инкубации под влиянием Тимодепрессина (M + m)

 

Показатель

             10 мкг/мл

            0,005 мкг/мл

 

1 час 37оС

пост.введ.

1 час 37оС

пост.введ.

1    

КР микс

 0,34 + 0,01

0,07 + 0,05

2,04 + 1,3

    4,5 + 2,7

2  

КР эр

 0,7 + 0,05

0,194 + 0,07

1,23 + 0,18

    2,1 + 0,8

3

КР г/м

 0,46 + 0,09

0,36 + 0,13

1,31 + 0,07

   1,3 +  0,07

 

    Как следует из полученных данных, часовая инкубация повторяет эффект крайних доз Тимодепрессина на предшественники разных классов, однако по сравнению с постоянным введением препарата стимулирующее и ингибирующее действие менее выражено.

    Поскольку эритроидные предшественники представлены бурстобразующими и колониеобразующими единицами, мы исследовали влияние Тимодепрессина и на их пролиферацию, как при постоянном введении, так и при одночасовой инкубации (таблица № 4).

 

Таблица 4

Значения КР при культивировании в метилцеллюлозе эритроидных предшественников под влиянием Тимодепрессина (M + m)

 

  10 мкг/мл

   1 мкг/мл

  0,05 мкг/мл

 0,005 мкг/мл

      КР БОЕ

  0,24 + 0,18

  0,51 + 0,26

  1,1 + 0,34

   2,8 + 0,69

      КР эр

  0,21 + 0,1

  0,45 + 0,18

  0,74 + 0,05

   0,95 + 0,24

 

Отмечается двухфазный эффект препарата на БОЕ, схожий с воздействием на КОЕ микс: малые дозы стимулируют, а большие угнетают пролиферацию предшественников. На КОЕ эр Тимодепрессин оказывает дозозависимое подавляющее действие, за исключением дозы 0,005 мкг/мл, которая практически не влияет на КОЕ эр.

    Для того чтобы убедиться в том, что полученные результаты не являются чисто культуральным феноменом, мы использовали другую систему – «агаровая капля – жидкая среда» для анализа влияния Тимодепрессина на гранулоцитарно – макрофагальные предшественники. В ходе исследований использовали две дозы препарата, обладающие противоположным эффектом – 10 мкг/мл и 0,005 мкг/мл. Исследования также проводили при постоянном введении Тимодепрессина и при кратковременной инкубации. Необходимо отметить, что при добавлении препарата в агаровую культуру, не содержащую фидерные клетки (стандартный источник КСФ в этой культуре) роста колоний не отмечалось. Результаты культивирования КОЕ  г/м в агаровой культуре с Тимодепрессином при наличии фидера представлены в таблицах  №№ 5, 6.

Таблица 5

Влияние Тимодепрессина на величину эффективности клонирования и пролиферативный потенциал гранулоцитарно – макрофагальных предшественников в агаровой культуре (M + m)

 

      Контроль

     10 мкг/мл

     0,005 мкг/мл

        ЭК

    11,8 + 1,8

      6,2 + 1,1

     26,0 + 6,2

        КР

 

      0,53 + 0,14

     2,2 + 0,26

        ПП

     2,04 + 0,55

      0,97 + 0,37

     2,21 + 0,49

 

    При анализе данных обращает на себя внимание то, что характер воздействия Тимодепрессина на КОЕ г/м и ПП предшественников в этой культуральной системе такой же, как и в метилцеллюлозе: малые дозы усиливают, а большие тормозят колониеобразование.

 

Таблица 6

Сравнение влияния Тимодепрессина на величину эффективности клонирования и пролиферативный потенциал гранулоцитарно - макрофагальных предшественников при постоянном введении и кратковременной инкубации в агаровой культуре (M + m).

 

 

 

    Контроль

Концентрация Тимодепрессина

            0,005 мкг/мл

                  10 мкг/мл

 

 1 час 37оС    

пост.

введение

1 час

37оС

пост.

введение

1 час

37оС

 пост.

введение

ЭК

46,0 + 6,3

11,8 + 1,8

57,5 + 6,7

26,0 + 6,2

29,5 + 8,8

 6,2 + 1,1

КР

 

 

1,25 + 0,04

2,2 + 0,26

0,64 + 0,15

 0,53 + 0,14

ПП

1,68 +

 0,06

2,04+ 0,55

2,56+0,44

2,21 + 0,49

1,01 + 0,32

 0,97 + 0,37

 

    Часовая инкубация подтверждает данные, полученные при постоянном введении препарата, однако, как стимулирующее, так и ингибирующее действие Тимодепрессина выражено в меньшей степени.

Обсуждение.

Тимодепрессин оказывает сложное воздействие на кроветворные предшественники человека: выраженный, дозозависимый эффект подавления колониеобразования ранних предшественников (КОЕмикс); небольшая стимуляция пролиферации эритроидных предшественников самыми малыми дозами (в исследованных пределах) Тимодепрессина при ингибирующем действии  более высоких доз; четкий двухфазный характер воздействия препарата на гранулоцитарно/макрофагальные предшественники.

 Для интерпретации этих эффектов представляется необходимым понять, действует ли Тимодепрессин непосредственно на клетки-мишени, или опосредованно через влияние на акцессорные клетки и/или известные цитокины. Отсутствие влияния Тимодепрессина на наиболее чувствительные к нему клетки-мишени – КОЕгм - в агаровой культуре без фидера, при спонтанном колониеобразовании, позволяет предположить отсутствие у них рецепторов к Тимодепрессину.

Реализация эффекта Тимодепрессина при наличии фидерных клеток предполагает два возможных объяснения: выброс фидерными клетками колониестимулирующих ростовых факторов в ответ на действие Тимодепрессина и конформация акитивности колониестимулирующих цитокинов. Опыт работы Тимодепрессина в метилцеллюлезной культуре делает более правомочным второе предположение. При культивировании предшественников в метилцеллюлезе Тимодепрессин реализует ту же, что и в агаровой культуре, активность без фидерных клеток, при наличии расстворенных в среде цитокинов. При этом Тимодепрессин может взаимодействовать с находяшимися в среде цитокинами или работать на уровне  их трансмембранных рецепторов.

Данные о том, что часовая преинкубация клеток-мишеней с Тимодепрессином способна полностью воспроизвести эффект его действия заставляют предположить, что Тимодепрессин скорее всего реализует свое действие на уровне рецепторов. Это предположение подкрепляется и результатами сравнения действия Тимодепрессина с однолинейным ростовым фактором G-CSF. Известно, что плотность рецепторов к G-CSF на гранулоцитарно/макрофагальных клетках-предшественниках человека очень низка, что не позволяет ему стимулировать их колониеобразовани. Однако более ранние колониестимулирующие факторы (IL-3, GM-CSF и др.) вызывают экспрессию рецепторов к этому цитокину (2). Наиболее вероятным является предположение о том, что Тимодепрессин действует через рецепторы цитокинов после их специфической активации, в малых дозах стимулируя, а в больших блокируя прохождение сигналов от соответствующих ростовых факторов.

Была предпринята попытка косвенным путем выяснить рецепторы каких цитокинов более афинны к Тимодепрессину. В использованной нами метилцеллюлезной культуральной среде присутствуют следующие цитокины: IL-3, GM-CSF, EPO. Хорошо известно, что экспрессия рецепторов к этим цитокинам различна у разных клеток- предшественников (2). Так, КОЕ микс и БОЕ экспрессируют рецепторы к IL-3 и GM-CSF, КОЕ эр к ЭРО, а КОЕгм – только к GM-CSF. На уровне КОЕ микс, отличающихся самой высокой экспрессией IL-3R, наблюдается наиболее выраженный дозозависимый и блокирующий эффект действия Тимодепрессина. EPO-R также реализует по-видимому блокирующее действие Тимодепрессина. На клетки с высокой плотностью рецепторов к GM-CSF (БОЕ и КОЕгм) Тимодепрессин оказывает описанное выше двухфазное действие.

Итак, клетки – предшественники гемопоэза человека испытывают на себе сложное воздействие Тимодепрессина, которое реализуется скорее всего через конформацию специфических рецепторов ростовых факторов.

Литература

1.       Владимирская Е.Б., Замараева Н.В., Волынец М.Д. идр.// Педиатрия.-1997.-№4.-с.4-9

2.       Rasko J.,Nicola N.,Johnson G.,Vttcalf D.// Blood.-1997.-v.89.-p.65-72.

3.       Semina O., Semenets T., Deigin V. e.a.//Immunology letters//1996.-v.51.-p.137-140.

4.       Deigin V.I., Poverenny A.M., Semina O.V., Semenets T.N.//Immunology letters// 1999 , v.67,- p.41-46.