Состояние популяции мононуклеарных фагоцитов (CD68) в псориатической папуле под влиянием Тимодепрессина

 

А.И. Новиков, В.А. Охлопков, Р.В. Городилов, О.В. Правдина, Е.Ю. Зубарева, Е.К. Медведчиков, А.В. Кононов.

 

Введение

 

 Известные в настоящее время методы и способы лечения псориаза не гарантируют стойкого регресса псориатических элементов [1]. В связи с этим, представляется оправданным введение в схемы лечения больных среднетяжелыми и тяжелыми формами псориаза иммунносупрессоров, с целью снижения ими общего количества Т-лимфоцитов. Одним из перспективных препаратов на сегодняшнее время является Тимодепрессин – синтетический пептид, состоящий из D-аминокислотных остатков глутаминовой кислоты и триптофана. Он обладает иммуносупрессивным эффектом, неспецифически ингибируя реакции как клеточного, так и гуморального звеньев иммунитета. Показано, что в условиях терапии псориаза Тимодепрессин вызывает пропорциональное снижение как CD4+, так и CD8+ лимфоцитов. Известно, что Тимодепрессин в 2 раза ослабляет накопление гамма-интерферона в цитоплазме Т-клеток, который стимулирует миграцию макрофагов в очаг воспаления [2,3]. В связи с этим представляется интересным исследование воздействия данного фармакопрепарата на популяцию антигенпрезентирующих клеток, способных к экзогенной презентации антигена. С этой целью перспективным является исследование экспрессии молекулы CD68, описанной как маркер моноцитов/макрофагов, и представляющей собой гомолог мышиного макросиалина, члена семейства LAMP (лизосом-ассоциированных мембранных протеинов). Его экспрессия локализована преимущественно в мембране поздних эндосом [4]. Считается, что наличие у данного маркера ферментной активности препятствует повреждению мембран лизосомальными энзимами вследствие их деградации [5]. Кроме того, показано, что данная молекула процессирует антиген путем постепенного ферментного расщепления фагоцитируемых клеткой объектов [6]. После процессинга макрофаги презентируют антиген Т-лимфоцитам. Если при этом состоятся все необходимые и достаточные корецепторные взаимодействия с антигенпрезентирующей  клеткой, то Т-лимфоцит получит активационный сигнал и с этого момента начнется собственно иммунный ответ – лимфоцитарный, имеющий место при псориазе.

 

Материалы и методы

 

Оценка влияния комбинированной терапии с включением препарата Тимодепрессин на популяцию антигенпрезентирующих клеток проведена в дизайне открытого проспективного рандомизированного контролируемого исследования. Критерии включения: давность заболевания более 5 лет; обострения более 2-х раз в год; отсутствие результатов или кратковременные ремиссии после раз-личных видов иммуносупрессивной терапии в прошлом (кортикостероидные гормоны, метотрексат, ПУВА-терапия, циклоспорин А). Критерии исключения: возраст до 20 лет; лица, получающие другие виды иммуносупрессивной терапии на момент проведения исследования (кортикостероидные гормоны, метотрексат, циклоспорин А, ПУВА-терапия); клинические признаки вторичной иммунной недостаточности; наличие декомпенсированной хронической патологии. Под нашим наблюдением находилось 29 больных псориазом в возрасте от 20 до 55 лет.  Основную группу составили 16 пациентов, традиционное лечение которых было дополнено Тимодепрессином. Больные получили 3 курса Тимодепрессина по 1 мл в/м ежедневно в течение 5 дней с двухдневным перерывом. В группе сравнения наблюдалось 13 пациентов получивших только традиционную терапию (антигистаминные, гипосенсибилизирующие средства, витамины, мазевая терапия, УФО). Клиническая картина тяжести заболевания и регресса псориатических элементов оценивалась согласно международному индексу PASI. Значительное клиническое улучшение регистрировалось при снижении индекса PASI на 75%, что соответствует регрессу 80% высыпаний. Клиническое улучшение отмечалось при снижении индекса PASI на 25%-75%, когда псориатические очаги значительно уменьшались в размерах, разбивались на мелкие папулы, в том числе в области дежурных участков. За незначительное клиническое улучшение принималось снижение индекса PASI  менее чем на 25%, когда удавалось лишь остановить прогрессирование псориатического процесса, добиться прекращения патологического шелушения и некоторого уменьшения очагов поражения.

На первый день поступления и 21 день от начала проведения терапии всем пациентам производилась биопсия кожи спины с периферии псориатических элементов. Биоптаты фиксировали в течение 12-18 часов в нейтральном формалине (pH 7,2-7,4). Проводку и заливку материала осуществляли по общепринятой методике. Приготовленные срезы окрашивались гематоксилином и эозином с целью выявления общей гистологической картины. Иммуногистохимические методы проведены 13 пациентам (основная группа – 6 наблюдений, группа сравнения – 7 наблюдений). Осуществляли определение маркера моноцитов/макрофагов CD68 (mouse monoclonal anti-CD68, PG-M1, DakoCytomation), докрашивая срезы гематоксилином. Подсчитывали количество позитивных клеток в случайных 5 полях зрения при 300-кратном увеличении микроскопа. Полученные данные пересчитывали на 1 мм2 среза. Для обработки результатов исследования использовали методы вариационной статистики: определение средней арифметической и стандартного среднего отклонения. Достоверность различий между сравниваемыми группами оценивали с помощью непараметрического критерия для двух связанных групп Уилкоксона (W) и для двух несвязанных Манна-Уитни (U) с использованием программы “SPSS for Windows 11.5.0”

 

Результаты

 

В обеих группах пациентов на момент поступления патологический процесс носил распространенный характер и был представлен типичными для псориаза розовыми или красными папула-ми, а также бляшками различных размеров с характерными серебристыми чешуйками на поверхности, при поскабливании которых четко выявлялись патогмоничные для псориаза симптомы: стеариновое пятно, терминальная пленка, точечное кровотечение.

На  3-5 день лечения у всех больных основной группы отмечалось прекращение появления свежих эффлоресценций, уменьшались яркость воспалительных явлений и шелушение, снижалась активность субъективных ощущений. На дальнейших этапах лечения (15-18 день) наблюдался регресс папулезных высыпаний и бляшек, как в их центральной зоне, так и по периферии в виде «псевдоатрофического» ободка Воронова. Индекс PASI в основной группе на 1-й день лечения составлял – 24,4; на 21-й день – 8,6 (снижение индекса PASI в конце лечения составило 63%). Значительное клиническое улучшение отмечалось у 6 пациентов в основной группе; клиническое улучшение достигнуто у 10 больных; незначительное клиническое улучшение не отмечено ни у одного пациента основной группы.

 

При гистологическом исследовании на фоне терапии Тимодепрессином пациентов основной группы отмечалось уменьшение степени пролиферации эпидермальных тяжей и выраженность воспалительного инфильтрата. Характерным являлось отсутствие нейтрофильных лейкоцитов в биоптатах больных к 21 дню проведения терапии, а также уменьшение явлений ангиоматоза. CD68-позитивные клетки характеризовались гранулярным окрашиванием цитоплазмы и локализовались как в пределах воспалительного инфильтрата, так и в многослойном плоском эпителии (рис.1). Выявлено абсолютное снижение CD68-позитивных клеток на фоне терапии Тимодепрессином (рис.2), но данные отличия при использовании критерия Уилкоксона статистически не достоверны (р=0,075) (табл.1).

В группе сравнения на 6-8-й дни лечения у всех больных отмечалось прекращение появления свежих эффлоресценций, уменьшались яркость воспалительных явлений и шелушение, снижалась активность субъективных ощущений. Индекс PASI  на 1-й день лечения составлял – 23,1; на 21-й день –  12,4 (индекс снижения - 46%). Отмечено достоверно значимое увеличение индекса PASI у пациентов в группе сравнения к 21 дню терапии (рис.3). Значительное клиническое улучшение отмечалось у 1 пациента  группы сравнения; клиническое улучшение достигнуто в 11 случаях наблюдения; незначительное клиническое улучшение отмечено у 1 пациента. 

При гистологическом исследовании биоптатов пациентов группы сравнения на фоне терапии отмечалось снижение выраженности воспалительной реакции. Уменьшалось количество мононуклеарных клеток. Воспалительный инфильтрат на фоне лечения приобретал исключительно очаговый характер с локализацией в периваскулярном пространстве. В отдельных наблюдениях обнаруживались скопления клеточных элементов в субкорнеальных отделах эпидермиса с доминированием нейтрофильных лейкоцитов, в связи с этим гистологическая картина в таких биоптатах оценивалась как стадия прогрессирования дерматоза. При иммуногистохимических исследованиях CD68-позитивные клетки выявлялись как в пределах эпидермиса, так и дермы, вне зависимости от стадии дерматоза. При статистической обработке полученных данных выявлена тенденция к снижению количества CD68-позитивных клеток, но статистически значимого отличия при вычислении критерия Уилкоксона не обнаружено (р=0,091). Сравнивая количество CD68-позитивных клеток в биоптатах взятых после проведения терапии, статистически достоверных отличий между основной группой и группой сравнения получено не было (критерий Манна-Уитни U=21,0 p=1,00) (табл.1).

 

Обсуждение

 

На основании полученных клинических результатов следует отметить наличие эффективности Тимодепрессина в комплексной терапии больных псориазом. Выявлено сокращение сроков достижения желаемого клинического эффекта, о чем свидетельствует ранее прекращение появления свежих эффлоресценций, а также высокая эффективность Тимодепрессина вследствие достоверно значимого снижения индекса PASI в основной группе по сравнению с группой сравнения пациентов. При гистологическом исследовании биоптатов основной группы пациентов отмечалась выраженная тенденция к редукции воспалительного процесса. 

Тимодепрессин, являясь иммуносупрессорным агентом, подавляет реакции клеточного звена иммунитета вследствие абсолютного снижения субпопуляций активированных Т-лимфоцитов. Отсутствие статистически достоверных отличий по количеству CD68-позитивных клеток в биоптатах, взятых после лечения, говорит о том, что препарат не оказывает прямого влияния на субпопуляцию антигенпрезентирующих клеток миелоидного происхождения, а значит обладает селективным иммуносупрессивным действием. Полученное в нашем исследовании абсолютное снижение популяции макрофагов связано с разрывом порочного круга патогенеза, реализующегося через механизм иммунного синапса [7]. Поступающие экзогенным путем антигены, подвергаются процессингу в клетках миелоидного ряда, обязательным компонентом которых является эндосомальный компартмент, богатый молекулой CD68. Ферментное расщепление фагоцитируемого материала приводит к высвобождению антигенных детерминант, встраиваемых в молекулу главного комплекса гистосовместимости HLA-DR. Образовавшийся комплекс презентируется окружающим Т-лимфоцитам-хелперам, которые выделяют цитокины, активирующие резидентные антигенпрезентирующие клетки. Таким образом, благодаря избирательному подавлению Тимодепрессином Т-лимфоцитов будет уменьшаться и активация антигенпрезентирующего компартмента иммунного синапса, что в конечном итоге обрывает дальнейшую цепь иммунопатологических реакций. Кроме того, общее снижение в местах псориатических папул Т-лимфоцитов приводит к уменьшению выработки факторов, ответственных за миграцию клеток воспалительного инфильтрата, а также препятствует ускорению темпов пролиферации кератиноцитов. В совокупности это приводит к регрессу гистологических признаков прогрессирования псориатического процесса – уменьшение степени акантоза и снижению выраженности воспалительной реакции. 

 

Выводы

 

1.      Включение Тимодепрессина в комплекс традиционной терапии приводит к ранней стабилизации патологического процесса.

2.      На фоне терапии Тимодепрессином значительно снижается выраженность воспалительной инфильтрации псориатической папулы.

3.      Отсутствие у Тимодепрессина эффектов в отношении субпопуляций антигенпрезентирующих клеток и избирательное подавление исключительно активированных Т-лимфоцитов делает его препаратом селективного иммуносупрессивного действия.

 

 

 

 

 

 

Таблица к статье: А.И Новиков и соавторы: Состояние популяции мононуклеарных фагоцитов (CD68) в псориатической папуле под влиянием Тимодепрессина.

 

 

Таблица 1. Степень экспрессии CD68-позитивных клеток воспалительного инфильтрата

в биоптатах пациентов в 1 мм2 среза (M±σ)

 

 

1-й день исследования

21-й день исследования день

Основная группа

89,11±29,69

68,26±11,71

Группа сравнения

90,35±16,84

76,93±26,55

 

 

Список литературы

 

  1. Короткий Н.Г. Терапевтические возможности тимодепрессина у больных псориазом и механизмы его лечебного действия. / Н.Г. Короткий,  В.Ю. Уджуху,   А.Э. Абдулова  //  Вестник дерматологии и венерологии.- 2002.- №4.- С.58-60.
  2. Новиков А.И. Клинико-морфологическая оценка эффективности иммуносупрессивной терапии псориаза. / А.И.  Новиков, А.В. Кононов, Н.Г.   Короткий и др. // Клиническая дерматология и венерология. – 2003. - №3. – С.43-47
  3. Ярилин А.А. Тимодепрессин. Иммуномодулирующее действие in vivo и in vitro. / Ярилин А.А., Дейгин В.И., Семина О.В., Семенец Т.Н., Пинегин Б.В.. // Тезисы докладов X Юбилейного российского национального конгресса «Человек и лекарство». – 2002. – С.14-24.

4.      Linehan S.A. The mannose receptor is expressed by subsets of APC in non-lymphoid organs // S.A. Linehan // BMC Immunol. – 2005. – V.6. – P.1471-1477. 

5.      Saito, N. Ultrastructural localization of the CD68 macrophage-associated antigen in human blood neutrophils and monocytes / N. Saito, K. A. Pulford, J. Breton-Gorius, D. Y. Mason, E. M. Cramer //Am. J. Pathol. – 1991. – V.139. – P.1053 – 1059.

6.      Holness, C. L. Macrosialin, a mouse macrophage-restricted glycoprotein, is a member of the lamp/lgp family / C. L. Holness, R. P. da Silva, J. Fawcett, S. Gordon, D. L. Simmons // J. Biol. Chem. – 1993. – V.268. – P.9661 – 9666.

7.      Nickoloff, B.J. Recent insights into the immunopathogenesis of psoriasis provide new therapeutic opportunities / B.J. Nickoloff, Nestle F.O. // J. Clin. Invest. – 2004. – V.113. – P.1664 – 1675.